Méthode d'analyse du L-4-Nitrophénylalanine Méthyl Ester HCl (H-Phe(4-NO2)-OMe·HCl) (CAS : 17193-40-7)
La description : Placer environ 2 g d’échantillon dans une boîte de Pétri propre et sèche et observer l’apparence de l’échantillon. Reporting : signaler l’observation
Identification : Comparez le temps de rétention du pic majeur dans le chromatogramme de la préparation d'essai avec le temps de rétention du pic majeur dans le chromatogramme de la préparation d'adéquation du système tel qu'obtenu en pureté chromatographique par HPLC.
Perte au séchage : Sécher une bouteille de pesée peu profonde, bouchée en verre, à 105 ± 2 ℃ pendant 30 minutes. Laissez-le refroidir à température ambiante dans un dessiccateur. Pesez avec précision le flacon peseur avec bouchon et notez le poids (W1). Transférez environ 1 à 2 g de substance à tester, pesée avec précision, dans le flacon de pesée. En agitant doucement et latéralement, répartissez l'éprouvette aussi uniformément que possible sur une profondeur d'environ 5 mm. Pesez le flacon de pesée chargé et notez le poids (W2). Placer la bouteille chargée dans l'étuve de séchage, en retirant le bouchon et en la laissant également dans la chambre. Séchez l'échantillon à tester à 105 ± 2 ℃ pendant 3 heures. Dès l'ouverture de la chambre, fermez rapidement la bouteille et laissez-la revenir à température ambiante dans un dessicateur. Pesez avec précision le flacon peseur avec bouchon et enregistrez le poids (W3). Calculez le pourcentage de perte lors du séchage de l’échantillon en utilisant la formule suivante :
Calcul Perte au séchage (% p/p)= (W2-W3) ÷ (W2-W1) x 100
Contenu énantiomère par HPLC :
Produits chimiques et réactifs :
n-Qualité hexane AR
Qualité HPLC méthanol
Alcool isopropylique de qualité HPLC
Qualité diéthylamine AR
Normes : étalon L-4-Nitrophénylalanine méthylester HCl ; L-4-Nitrophénylalanine Méthyl Ester HCl énantiomère standard
Phase mobile : Préparer un mélange homogène de n-Hexane, d'alcool isopropylique, de méthanol et de diéthylamine (65:20:15:0,1 v/v/v/v)
Préparation du blanc : Transférer 2,5 ml de méthanol dans une fiole jaugée de 10-ml, diluer au volume avec la phase mobile et mélanger.
Préparation à l'adéquation du système :
Peser avec précision et transférer environ 5 mg chacun de l'étalon L-4-Nitrophénylalanine Méthyl Ester HCl et de l'étalon énantiomère L-4-Nitrophénylalanine Méthyl Ester HCl dans une fiole jaugée de 10-ml, dissoudre dans environ 2,5 ml de méthanol, diluer au volume avec la phase mobile et mélanger.
Préparation aux tests :
Peser avec précision et transférer environ 5 mg d'échantillon dans une fiole jaugée de 10-mol, dissoudre dans environ 2,5 ml de méthanol, diluer au volume avec la phase mobile et mélanger.
Paramètres instrumentaux :
Instrument : HPLC équipé d'un injecteur, d'une pompe, d'un détecteur UV et d'un enregistreur
Colonne : ChiralPak-IC (4,6 mm x 250 mm) 5 μ ou équivalent
Débit : 1,0 ml/minute
Longueur d'onde : 260 nm
Volume d'injection : 10 μL
Température du coven de la colonne : 25 ℃
Durée : 20 minutes
Procédure
Injectez les solutions comme mentionné dans l’ordre suivant. Enregistrez les chromatogrammes et confirmez les critères :
Description des injections Nombre d’injections Critères
Préparation à blanc 1 Aucun pic interférent ne doit être observé au temps de rétention du L-4-Nitrophénylalanine Méthyl Ester HCl ou de l'énantiomère.
Préparation de l'adéquation du système 1 La résolution entre le L-4-Nitrophénylalanine Méthyl Ester HCl et le pic de l'énantiomère ne doit pas être inférieure à 2,0
Préparation du test 1 Utiliser le chromatogramme de test pour déterminer la teneur en énantiomères de l'échantillon.
Temps de rétention relatifs :
L-4-Ester méthylique de nitrophénylalanine HCl 1,0
Énantiomère À propos de 1,11
Le temps de rétention du L-4-Nitrophénylalanine Méthyl Ester HCl est d’environ 9,8 minutes.
Calcul : Dans le chromatogramme obtenu à partir de la préparation du test, ne tenez pas compte de tous les pics, à l'exception du L-4-Nitrophénylalanine Méthyl Ester HCl et Enantiomer. Signalez la teneur en énantiomère de l’échantillon par méthode de normalisation de zone.
Pureté chromatographique et impuretés par HPLC :
Produits chimiques et réactifs :
Phosphate diammonique de qualité AR
Acide phosphorique qualité AR
Qualité HPLC méthanol
Eau purifiée
Normes
L-4-Nitrophénylalanine Méthyl Ester HCl standard
4-Nitro-L-Étalon de phénylalanine monohydraté
Phase mobile-A
Dissoudre 6,6 g de phosphate diammonique dans 1000 ml d'eau purifiée. Ajustez le pH de cette solution à 6,0 avec de l'acide phosphorique. Filtrer et dégazer. Avant de mesurer le pH de la solution, calibrez le pH-mètre avec une solution tampon étalon pH 4,01 ET 7,00.
Phase mobile-B
Qualité HPLC méthanol
Préparation à l'adéquation du système
Peser avec précision et transférer environ 25 mg chacun de l'étalon L-4-Nitrophénylalanine Méthyl Ester HCl et de l'étalon 4-Nitro-L-Phénylalanine monohydraté dans une fiole jaugée de 50-ml, dissoudre et diluer au volume avec du méthanol et mélanger.
Préparation aux tests :
Peser avec précision et transférer environ 25 mg d'échantillon dans une fiole jaugée de 50 ml, dissoudre et diluer au volume avec du méthanol et mélanger.
Paramètres instrumentaux :
Instrument : HPLC équipé d'un injecteur, d'une pompe, d'un détecteur UV et d'un enregistreur
Colonne : XTerra RP-18 (4,6 mm x 150 mm) 5 μ ou équivalent
Débit : 1,0 ml/minute
Longueur d'onde : 265 nm
Volume d'injection : 20 μL
Température du coven de la colonne : 25 ℃
Durée : 45 minutes
Programme de dégradé
Temps (min) Phase mobile-A % Phase mobile-B %
0,01 90 10
15 60 40
35 40 60
40 35 65
41 90 10
45 90 10
Procédure :
Injectez les solutions comme mentionné dans l’ordre suivant. Enregistrez les chromatogrammes et confirmez les critères :
Préparation à blanc 1 Aucun pic interférent ne doit être observé au temps de rétention du L-4-Nitrophénylalanine Méthyl Ester HCl.
Préparation de l'adéquation du système 1 Le facteur de queue pour le pic de L-4-Nitrophénylalanine Méthyl Ester HCl ne doit pas être inférieur à 2,0.
Préparation du test 1 Utilisez le chromatogramme de test pour déterminer la pureté et les impuretés chromatographiques.
Temps de rétention relatifs :
L-4-Nitrophénylalanine Méthyl Ester HCl 1,0 (temps de rétention environ 11,4 minutes)
4-Nitro-L-Phénylalanine Environ 0,4
Toluène Environ 2,3
Calculs :
Dans le chromatogramme obtenu à partir de la préparation du test, après correction du blanc, ne pas tenir compte du pic dû au toluène. Indiquez la pureté chromatographique, la teneur en 4-Nitro-L-Phénylalanine et les impuretés totales de l'échantillon par méthode de normalisation de zone.